發(fā)光法測定酶的催化活性

發(fā)光法測定酶的催化活性，發(fā)光法應用熒光、磷光以及化學發(fā)光等作為檢測器體系?；畹纳矬w中觀察的化學放 光稱作生物體發(fā)光。生物體發(fā)光是由成為熒光素酶的酶類催化產生的，這類酶的底物即蟲熒 光素，被轉化為發(fā)光產物。

在發(fā)光法中，單位時間內反應體系發(fā)射的光子數(shù)目可以由特殊設 計的儀器——照度計來測量，這類儀器是以單光子探測器為基礎的，通常是光電倍增管。 由來源于螢火蟲的熒光素酶催化的反應就是一個例子，螢火蟲熒光素4-單加氧酶（ATP 水解酶） ATP+D-蟲熒光素+O2→氧合蟲熒光素+AMP+pp+CO2+0.9hν 在該反應中，ATP 作為底物被消耗掉，光子在 562nm 的波長處發(fā)射。每摩爾的蟲熒光 素的量子產量是0.9 愛因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大約發(fā)射1 個光子。因此該反應適 合用來測定ATP，從而測定那些能夠催化ATP 消耗或者是ATP 生產的反應的那些酶。 為借助于螢火蟲的生物發(fā)光來檢測酶的活性，光強度必須在幾分鐘內呈線性增加，而且 必須嚴格正比于酶的催化活性。這些測定條件在測定肌酸激酶的催化活性時，已經得到了實 現(xiàn)。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP 其他依賴于NAD（P）的反應可以通過來源于發(fā)光細菌的生物發(fā)光來跟蹤檢測。

過氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測定 —愈創(chuàng)木酚法

一、實驗原理 過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反 應，產物為醌類化合物。 實驗以愈創(chuàng)木酚為過氧化物酶的底物。 在此酶存在下，H2O2 將愈創(chuàng)木酚氧化生成 茶褐色產物。此產物在470nm 有最大光吸 收，故可通過470nm處的吸光度變化測定過 氧化物酶的活性。

二、材料和設備

１、材料 ：馬鈴薯塊莖 ２、儀器設備：751 型分光光度計、離心機、研 缽、25ml 容量瓶、量筒、試管、吸量管。 ３、試劑：0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液， 0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5)， 2%H2O2， 0.1mol/L兒茶酚溶液， 20%三氯乙酸溶液

三、實驗步驟

１、酶液的制備 取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放 入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻 漿。將勻漿液全部轉入離心管中，于3000g 水中離心10min，上清液轉入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提?。泊?，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下 保存?zhèn)溆谩?２、過氧化物酶活性的測定 酶活性測定的反應體系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml 2%H2O2、 1.0ml 0.05mol/L 愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加熱5min的酶液為對 照，做二組重復實驗。反應體系加入酶液 后，立即于37℃水浴中保溫15min，然后迅 速轉入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙 酸終止反應。然后，過濾(或5000g 離心 10min),濾液適當稀釋，用751型分光光度 計在470nm波長下測定反應體系的吸光度。

四、實驗結果

以每min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活力單位 酶活力=——× D △A 0.01t 酶的比活力=——× D △A 0.01Wt 式中， △A為反應時間內吸光度的變化；W為馬鈴 薯鮮重（g）；t為反應時間（min）；D為稀釋倍數(shù)， 即提取的總酶液為反應系統(tǒng)內酶液的倍數(shù) CAT過氧化氫酶活性測定方法 過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)又名 觸酶(Catalase，CAT)，是一類以鐵卟琳為 輔基的結合酶，由4個亞基組成，分子量為 240 000。存在于動植物組織與細胞中的氧 化還原酶類，它專一性地將細胞代謝產生 的過氧化氫分解成H2O和02，避免了H202在體 內積累，從而可維持體內正常的活性氧水 平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關的氧化 酶類之一.

過氧化氫酶的應用： 被用于食品包裝，防止食物被氧化。 在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過氧化氫，以保證成品是不含 過氧化物的。 它還被用在隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過氧化氫的清潔劑中浸泡 后，使用前再用過氧化氫酶除去殘留的過氧化氫。

近年來，過氧化氫酶開始使用在美容業(yè)中。一些面部護理中加入了該 酶和過氧化氫，目的是增加表皮上層的細胞氧量。 植物細胞中的過氧化物酶體參與了光呼吸（利用氧氣并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（將氮氣(N2）解離為活性氮原子）。細胞被病原體 感染時，過氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。 其活性也與糧食品質之間有一定的相關性，是一項衡量谷物品質的 重要指標。

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