谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase）的活性檢測(cè)方法

1. 目的

本程序是為了建立谷氨酸脫氫酶（Glutamate Dehydrogenase）的活性檢測(cè)方法，適用于GLDH成品的活性檢測(cè)。

2. 范圍

  適用于GLDH成品、半成品及其他樣品的檢測(cè)。

4. 定義

   U: 在pH7.3, 37度的環(huán)境下, 每分鐘轉(zhuǎn)化1umolα-酮戊二酸變成L-谷氨酸所需要的酶量。

   活性: 每毫升樣品中的活性值。

   比活: 每毫克蛋白的活性值。

5. 內(nèi)容

5.1原理

α-Ketoglutarate + NH₃ + NADH + H⁺        L-Glutamate+ NAD⁺ +H₂O

NADH的消耗可以通過(guò)340nm的光吸收進(jìn)行檢測(cè)。

5.2試劑：

A  0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3

B  1.5M NH₄Cl溶液

C  0.225M α-酮戊二酸溶液(pH 7.0-9.0)

D  7.5mM NADH溶液

E   酶稀釋液: 0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3

試劑的配制方法詳見(jiàn)各試劑配制記錄,配制人員需完整填寫(xiě)配制記錄。

5.3 操作規(guī)程：

5.3.1儀器參數(shù)設(shè)定

若儀器中無(wú)已保存參數(shù)，按以下參數(shù)設(shè)定。若已有相關(guān)參數(shù)，調(diào)取后確認(rèn)。

檢測(cè)方法：動(dòng)力學(xué)掃描

測(cè)量波長(zhǎng)：340nm         測(cè)量時(shí)間：180s

延遲時(shí)間：60s            積分時(shí)間：120s

系數(shù)/因子：6.776          測(cè)量溫度：30±1℃

5.3.2 樣品準(zhǔn)備

若待測(cè)樣品為固體，可以按10mg 樣品/1000ul 超純水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。

5.3.3 檢測(cè)方法

5.3.3.1 在石英比色皿中加入2.5ml 試劑A, 200ul試劑B,100ul 試劑C, 100ul D于30度孵育2min。

5.3.3.2 加入50ul 樣品后, 溫和混勻后開(kāi)始測(cè)定。

5.3.3.3 測(cè)定結(jié)束后，記錄相應(yīng)數(shù)值：起始讀數(shù)、△A/min test、活性值（U/ml）。

5.3.3.4 活性值（U/ml）范圍為0.1-0.3U/ml，若超出范圍，待測(cè)樣品需經(jīng)試劑D稀釋后再次進(jìn)行檢測(cè)。

5.3.3.5測(cè)定樣品前需檢測(cè)空白反應(yīng)值，即其他操作不變，用500ul E代替樣品加入比色皿后進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定△A/min blank。

5.3.3.6計(jì)算公式  活性(U/ml) =(△A/min test-△A/min blank)×6.776×df （稀釋倍數(shù)）

5.4 成品檢測(cè)結(jié)果精密度要求：每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)，在線(xiàn)性范圍內(nèi)選擇三個(gè)不同的稀釋度進(jìn)行測(cè)定，得到的原液/粉末活性,計(jì)算Cv值,Cv值得要求為<5%,達(dá)到要求后,此次測(cè)定的結(jié)果認(rèn)為有效, 取三個(gè)檢測(cè)數(shù)值的平均數(shù)作為最終的檢測(cè)數(shù)值。若不能達(dá)到,對(duì)此三個(gè)稀釋?xiě)?yīng)進(jìn)行重新檢測(cè)。

此方法僅作為參考！